高h肉辣文交换_好吊妞视频haodiaoniucom_羞羞漫画登录页面免费入口_美国一级片视频

近年來，細胞外囊泡（EV）相關的研究正加速發展。2011年每年有約200篇相關論文發布，但2016年一年間有1000篇以上的相關論文發布，論文內容涉及各種生理功能和病理癥狀等方面。EV大致可分為核內體來源的外泌體和細胞質膜來源的微囊泡，但即便是用提取純度最高的超速離心法也難以將二者完全分離，所以簡單地將10,000×g離心后上清中的EV稱為小EV（主要是外泌體）^1）。外泌體是由各種細胞分泌的小型膜囊泡（直徑30~100nm），存在于大多數體液（如血液、尿液、髓液等）和細胞培養液中。外泌體是由脂質雙層膜包被的膜囊泡，產生于稱為多囊泡體的細胞外囊泡中，多囊泡體通過與細胞膜融合將外泌體釋放到細胞外。外泌體含核內體來源的蛋白質（如ESCRTs）、細胞內運輸相關蛋白（如RabGTPase等）及細胞膜來源蛋白（如CD63, CD81等）等各種內分泌細胞來源的蛋白和RNA，同時還含有分泌細胞膜來源和內體膜來源的脂質（如膽固醇和鞘磷脂等）^2）。多年來，外泌體被認為參與無用的細胞內含物質的釋放。但是近年來，外泌體在活體內作為運載脂質、蛋白質、RNA等細胞間信息傳遞的新型媒介而倍受矚目。隨著其功能在生理及病理功能的闡明，外泌體在臨床應用的相關研究中，特別是診斷治療、生物標記的開發也迅速發展起來。

　　現在，外泌體研究幾乎涉及所有的研究領域（免疫、神經系統、癌癥、內分泌、循環系統等）。例如，免疫細胞來源的外泌體含有抗原肽/MHC復合體和可能控制著免疫細胞間抗原信息的交換、免疫細胞活化/非活化等各種免疫應答機制的各種抗原^3）。外泌體在神經系統中與神經回路的控制相關^4），同時各種神經退行性疾病的致病蛋白還可以通過外泌體釋放到細胞外并傳遞到其他細胞，與病情發展密切相關^5）。 癌細胞釋放的外泌體含有許多與血管新生和免疫逃逸相關的分子，構建適合癌細胞生長的微環境，促進癌細胞的發展^6）。另外，癌細胞來源的外泌體上粘著分子的表達形式決定著癌癥向器官的轉移途徑^7）。最近，有報告指出脂肪細胞釋放的外泌體對肝臟的遺傳基因表達有控制作用^8）。許多病毒利用外泌體的產生路徑感染細胞，受病毒感染的細菌和寄生蟲通過外泌體控制其他受細胞感染的細菌、寄生蟲的活動^9、10）。

　　上述這些功能幾乎都是通過細胞分泌到外泌體中的分子引起的。其中已發現外泌體內含有分泌細胞來源mRNA和miRNA，外泌體與細胞間遺傳基因表達信息的水平傳播相關性倍受矚目^11）。這些RNA被外泌體的脂質雙層膜所保護，不會被核糖核酸酶所分解，可以在血液和體液中穩定存在。被靶細胞吞噬的外泌體通過與內體膜融合，將RNA釋放到靶細胞的細胞質中。釋放出來的mRNA翻譯為蛋白質，但miRNA抑制目的基因的翻譯，因此外泌體在靶細胞內控制基因的表達。外泌體的蛋白質有數萬種，mRNA、miRNA的種類有數千種以上，它們的結構除了受細胞來源不同的影響，還受到細胞狀態不同的影響。另外，外泌體中這些物質的結構與它們在分泌細胞內的結構不同，所以可能存在一種外泌體特異蛋白和mRNA/miRNA在外泌體內選擇性積累的機制。這種特異性可將外泌體內的RNA作為生物標記，更進一步作為治療開發方法的靶點。外泌體中的mRNA一旦被靶細胞吞噬，能夠引起這個細胞內的功能性蛋白的表達，但外泌體中多數的miRNA是前體而非功能性miRNA，這些miRNA起著何種生理性意義，學者們正在研究。由于外泌體含有各種蛋白質、RNA和脂質，研究人員正將其進行細胞分類，建立數據庫（ExoCarta）。此外，在世界各地分別進行著運用蛋白質組學、轉錄組學和系統生物學的大規模分析工作，而FunRich的EV plugin作為一種通用的分析手段已被公布出來。今后，在推進外泌體研究方面，各領域的研究人員信息共享至關重要。

 ◆運用外泌體進行治療和診斷的功能開發

　　隨著外泌體的功能逐漸被發現，近年來，應用這些功能的治療法也在被開發出來。例如，血液中的成纖維細胞所釋放的外泌體，可以促進角質形成細胞的移動和增殖以及血管新生來促進傷口愈合。有報導指出，外泌體內miRNA參與促進血管新生、抗炎癥性和促進膠原蛋白沉淀等一系列過程^12）。從癌癥患者樹突狀細胞釋放的外泌體中，含有各種癌癥細胞來源的蛋白質，可以強化殺傷性T細胞對癌癥細胞的特異性反應。利用此功能的抗腫瘤免疫療法，目前正處于初期臨床研究階段^13）。另外，科學家也嘗試利用外泌體的抑制發病機制功能。例如，類風濕關節炎患者的滑膜成纖維細胞所釋放的外泌體，高濃度集聚誘導細胞死亡的TNF-α，可使類風濕關節炎惡化^14）。通過上述介紹可以知道癌癥細胞來源的外泌體含有與癌癥進展相關的分子，神經細胞來源的外泌體含有與神經退行性疾病相關的分子，因此，通過抑制或去除這些外泌體，有希望抑制疾病發生。隨著今后的研究發展，外泌體功能逐步清晰，并擴大臨床應用，有望將外泌體應用在各種疾病治療上。甚至可嘗試利用外泌體將siRNA和抗癌藥劑等運輸到目標細胞中。各種細胞粘著分子在外泌體膜表面表達，由其決定外泌體被運輸往哪一種細胞，期望開發利用該特征的新型DDS^15）。外泌體在體液中十分穩定，同時外囊泡所含的蛋白質和RNA被外泌體的脂質雙層膜所包被也不會分解。另外在從體液中提取外泌體后，體液可長期穩定保存，因此外泌體有望成為臨床檢測的新型疾病生物標記。外泌體與各種疾病的相關性被檢測出，特別是血液中釋放的癌細胞來源的外泌體，其與正常細胞來源外泌體在結構分子上的差異倍受矚目，并作為癌癥早期診斷技術，應用于與癌癥進展相關的研究^16）。甚至人們期望將尿液中的外泌體作為腎臟、前列腺疾病、膀胱疾病的新型診斷標記，髓液中的外泌體作為腦內腫瘤和神經退行性疾病的新型標記物。

 ◆外泌體研究的課題和展望

　　已經有許多關于外泌體作用的報導，根據這些現象實驗中，從體液和培養上清中高純度提取的高純度外泌體，在活體內是否真的能發生作用尚未能確定。確認外泌體生理作用的唯一方法就是明確外泌體的釋放機制，通過促進或抑制釋放機制，分析會引起何種生理作用，這是進一步研究的發展方向。甚至活體內的外泌體動態（哪個外泌體遷移至何處）也會成為今后需要努力研究的重要課題。

　　目前，提取外泌體的方法主要有超速離心法、PEG沉淀法，但這些方法混有非常多的雜質，必須慎重分析得到的是否是外泌體。超速離心法存在操作繁雜、回收量不穩定，不能用于定量分析、必須使用昂貴的超速離心機、無法進行多樣品分析等問題。因此外泌體研究相對困難，需要盡快開發操作簡單、可提取高純度外泌體的技術。因此，日本和光著眼于巨噬細胞的外泌體受體Tim4蛋白，制備Tim4細胞外域與磁珠結合的“Tim4磁珠”^17）。Tim4通過磷酯酰絲氨酸（PS）法特異性結合Tim4蛋白和磁珠，再經過含有EDTA的洗脫緩沖液進行分離，提取高純度的完整外泌體。實際上，用PS親和法提取的人白血病細胞釋放的外泌體，其純度與超離心法和PEG沉淀法提取外泌體做比較， PS親和法提取的外泌體，其蛋白特異性檢測可高出10~100倍以上，幾乎沒有混入外泌體以外的蛋白，回收量高，操作重復性好。結果表明，PS親和法可以檢測到許多目前為止都無法檢測的外泌體蛋白質和RNA。應用Tim4的外泌體強結合能力，可用ELISA或FACS高靈敏度定性檢測、定量分析外泌體。以前無法用超速離心法提取的微囊泡，也通過運用PS親和法實現高純度提取。本指導書中對該技術進行詳細說明，這項技術的有用性今后將受到世界各方評價，有望在外泌體和微囊泡生理功能的分析研究上起重大貢獻。

　　外泌體的檢測和提取還遇到一個困難即：對各種外泌體的分類。研究人員尚未統一定義以何種方法提取的細胞外囊泡可以稱之為外泌體，給實驗數據的分析和重復性確認帶來困難。近年，隨著國際細胞外囊泡協會的成立、世界性研究者研討會的舉辦，提案MISEV指南作為國際標準，計劃或已經開始進行EV研究的科學家請務必閱讀這些方針^18、19）。另外，建立記錄各論文實驗條件的數據庫也可作為規避混亂的方法之一^20）。一方面，隨著EV研究倍受世界矚目，各國啟動了大型研究項目。美國啟動NIH戰略性大型項目（Extracellular RNA Communication），國際權威性學會——Gordon和Keystone Symposia也從2016開始成立會議小組。受到歐洲藥物研究開發公司“創新藥物倡議組織（IMI）”的支持推進的CANCER-ID項目，也包含EV研究在內。2017年日本選定了EV研究為文部科學省研究開發戰略的目標之一，期待會加速今后的研究發展。無論如何，今后EV研究的根本就是必須有強有力的研究方法和技術，而PS親和法有望成為其中之一。

◆參考文獻

MagCapture? 外泌體提取試劑盒 PS Ver.2
提高回收率和純化純度的外泌體提取/純化試劑盒

本試劑盒是提取/純化外泌體的試劑盒，比起第一代產品（293-77601 MagCapture? 外泌體提取試劑盒PS），提高了外泌體的回收率和純度，并縮短了實驗操作的時間。使用本試劑盒純化的外泌體可以直接用于細胞攝取實驗。

◆特點

●　提高了外泌體的回收率和純度

●　縮短親和反應的時間（3 h→1 h）

●　降低純化外泌體的細胞毒性

◆數據

■  比較外泌體的回收率

Western blotting EV標記的比較

編輯搜圖

在間充質干細胞（MSC）的培養上清中，使用第一代產品（圖中簡寫為Ver.1）和本試劑盒（圖中簡寫為Ver.2）提取和純化含外泌體的細胞外囊泡（圖中簡寫為EV）。然后，對所得樣品進行納米級粒子數檢測以及使用PS MagCapture? 外泌體 ELISA Kit（鏈霉親和素HRP）（產品編號：298-80601）和WB比較EV標記物。

Ver.2與Ver.1相比，回收率有所提高。

■　比較純化外泌體的細胞毒性

編輯搜圖

使用Ver.1和Ver.2提取和純化COLO201細胞培養上清中含外泌體的細胞外囊泡。然后僅將elution buffer或純化外泌體加入到人正常成纖維細胞中，觀察經過48 h后的細胞形態變化。

在Ver.1中，加入外泌體和elution buffer后48 h出現了細胞死亡，而Ver.2中未觀察到明顯的細胞毒性。證明Ver.2中elution buffer的細胞毒性已經降低了。

■　比較不同親和反應時間里外泌體純化的回收率

編輯搜圖

在COLO201細胞培養上清中，為Ver.2設定4個親和反應時間條件，提取和純化含外泌體的細胞外囊泡（EV）。然后，獲得的樣品使用PS MagCapture? 外泌體 ELISA 試劑盒（鏈霉親和素HRP）（產品編號：298-80601）比較EV表面標記物。

在Ver.2中，確認了1 h的親和反應可以充分提取到培養上清中的細胞外囊泡。

產品列表