酵母雙雜交系統(tǒng)的建立得力于對(duì)真核細(xì)胞調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始過程的認(rèn)識(shí)。研究發(fā)現(xiàn)，許多真核生物的轉(zhuǎn)錄激活因子都是由兩個(gè)可以分開的、功能上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域(domain)組成的。例如，酵母的轉(zhuǎn)錄激活因子GAL4，在N端有一個(gè)由147個(gè)氨基酸組成的DNA結(jié)合域(DNA binding domain,BD)，C端有一個(gè)由113個(gè)氨基酸組成的轉(zhuǎn)錄激活域(transcription activation domain,AD)。GAL4分子的DNA結(jié)合域可以和上游激活序列(upstream activating sequence，UAS)結(jié)合，而轉(zhuǎn)錄激活域則能激活UAS下游的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。但是，單獨(dú)的DNA結(jié)合域不能激活基因轉(zhuǎn)錄，單獨(dú)的轉(zhuǎn)錄激活域也不能激活UAS的下游基因，它們之間只有通過某種方式結(jié)合在一起才具有完整的轉(zhuǎn)錄激活因子的功能。
在蛋白質(zhì)相互作用研究工作中，酵母雙雜交技術(shù)往往是很多研究者的科研利器。然而酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)的流程相對(duì)復(fù)雜，許多剛剛開展實(shí)驗(yàn)的老師很容易遇到各種各樣的問題，不知道該如何應(yīng)對(duì)。百瑞極將帶您解密 Gold酵母雙雜交系統(tǒng)，將收集匯總的酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)常見問題和應(yīng)對(duì)方法分享給大家！以此為您的實(shí)驗(yàn)保駕護(hù)航，再無后顧之憂！
為什么要使用酵母表達(dá)系統(tǒng)來進(jìn)行蛋白質(zhì)互作研究? 酵母可以提供一個(gè)體內(nèi)真核系統(tǒng)，同時(shí)又兼具原核細(xì)菌系統(tǒng)的可操作性強(qiáng)、簡(jiǎn)單易用的優(yōu)點(diǎn)。在酵母體內(nèi)表達(dá)的蛋白質(zhì)可以正確的折疊；提供中性pH內(nèi)部環(huán)境；可以形成二硫鍵和其他真核系統(tǒng)共有的翻譯后修飾。這些特點(diǎn)對(duì)于維持天然蛋白結(jié)構(gòu)獲得真實(shí)的蛋白質(zhì)互作關(guān)系至關(guān)重要。同時(shí)，酵母可操作性強(qiáng)，并且已進(jìn)行全基因組測(cè)序。利用同源重組可以很方便地直接在酵母中構(gòu)建文庫。 用于酵母雙雜交篩選的bait蛋白質(zhì)有什么要求? Bait蛋白質(zhì)應(yīng)該是核蛋白質(zhì)或胞漿蛋白質(zhì)；分泌型蛋白質(zhì)不能用作bait;通常來講，bait不能帶有跨膜結(jié)構(gòu)域；bait和prey的互作不能依賴于糖基化，這是由于酵母翻譯后修飾不包括糖基化；bait與GAL4 BD域融合表達(dá)后可以正確的折疊；bait不能激活酵母中轉(zhuǎn)錄報(bào)告基因的表達(dá)(即不能有自激活活性)。 以經(jīng)驗(yàn)來看，bait不宜過大，過大的外源性融合蛋白在酵母中不穩(wěn)定，我們推薦bait不超過100 kD,或bait載體的DNA插入片段不超過3kb。大多數(shù)情況下，bait的設(shè)計(jì)依賴于經(jīng)驗(yàn)，很難確定bait的效果會(huì)如何。酵母雜交中插入片段的N端與147個(gè)氨基酸的GAL4 BD融合表達(dá)，這可能會(huì)影響蛋白折疊，以及插入的結(jié)構(gòu)域能否進(jìn)行蛋白質(zhì)互作。比較大的bait可能會(huì)引起非特異性互作而提高背景，推薦使用較小的、特異的bait進(jìn)行酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)。小至8個(gè)氨基酸，大至750個(gè)氨基酸的蛋白都已經(jīng)被成功用于酵母雙雜交研究。 做酵母mating實(shí)驗(yàn)的最佳時(shí)間是多久?需要注意什么? 酵母mating實(shí)驗(yàn)一般需要20-24小時(shí)。我們推薦通過檢測(cè)到顯微鏡下的三葉草結(jié)構(gòu)作為酵母接合反應(yīng)成功的根據(jù)，一般的酵母接合效率為2-5%左右。當(dāng)對(duì)誘餌菌株進(jìn)行液體培養(yǎng)過夜時(shí)，應(yīng)挑選大的、新鮮的克隆進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)過離心和重懸后，再使用血球計(jì)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，提高雜交效率。進(jìn)行mating實(shí)驗(yàn)時(shí)，需要低速搖菌30-50 rpm條件下培養(yǎng)，20 h后顯微鏡下觀察是否有接合反應(yīng)發(fā)生，若沒有繼續(xù)培養(yǎng)4 h。 酵母雙雜交可以用兩種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化一個(gè)菌株進(jìn)行蛋白相互作用的篩選嗎，與接合反應(yīng)相比較哪個(gè)效果好? 可以將兩種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化Y2H Gold菌株進(jìn)行蛋白相互作用的篩選，但這種方式的實(shí)驗(yàn)操作轉(zhuǎn)化效率不好控制，穩(wěn)定性不好。利用酵母菌有性生殖的過程，采用兩種不同類型的菌株(Y187和Y2H Gold),通過它們之間的有性接合反應(yīng)進(jìn)行篩選，篩選方式很科學(xué)，假陽性率低。 使用Matchmaker系統(tǒng)做酵母雙雜交，轉(zhuǎn)化效率很低(沒有做對(duì)照實(shí)驗(yàn)),這是什么原因? 建議先做對(duì)照實(shí)驗(yàn)；DNA質(zhì)量一定要高，可以用乙醇再次純化；DMSO和Carrier DNA質(zhì)量要高，最好是新鮮的，Carrier DNA在轉(zhuǎn)化之前最好用沸水變性；SD培養(yǎng)基pH值應(yīng)調(diào)為5.8,YPDA應(yīng)調(diào)為6.5。重新配制培養(yǎng)基，檢測(cè)對(duì)照的轉(zhuǎn)化效率；可能是BD載體翻譯出來的融合蛋白質(zhì)對(duì)酵母菌有毒性。 一般來說，保存于25%甘油的酵母菌株在每次解凍后會(huì)丟失10%的活力細(xì)胞。因此，大多數(shù)凍存的酵母在融化溫度不超過室溫而且操作小心的條件下，最多可容忍10次凍融。有兩個(gè)例外情況請(qǐng)注意：預(yù)制的酵母文庫和酵母感受態(tài)細(xì)胞。為篩選到基因覆蓋度最廣的文庫，預(yù)制的酵母文庫一旦解凍，就必須立即使用且不要重新凍存。同樣，為得到最高轉(zhuǎn)化效率，酵母感受態(tài)細(xì)胞應(yīng)該立即使用且避免凍存。 什么是均一化處理，為什么要進(jìn)行均一化處理? 均一化文庫是指某一特定組織或細(xì)胞的所有表達(dá)基因均包含其中，且在cDNA文庫中表達(dá)基因?qū)?yīng)的cDNA的拷貝數(shù)相等或接近。在均一化cDNA文庫中，高豐度基因與低豐度基因均衡，這就避免了在篩選的過程中由于基因組本身基因豐度的高低而影響到篩選概率的問題，因此這樣的文庫具有更高的基因代表性。使用雙鏈特異性核酸酶(Duplex-Specific Nuclease, DSN),降解雜交過程中形成的雙鏈DNA。高豐度的基因形成雙鏈的速度較快，所以降解也比較多，從而達(dá)到均一化的目的。 不可以，X-Gal與X-Alpha-Gal不同。X-Gal是E.coli β-半乳糖苷酶(LacZ)的反應(yīng)底物，而X-Alpha-Gal是酵母α-半乳糖苷酶(Mel1p)的反應(yīng)底物。X-Alpha-Gal在Matchmaker Gold系統(tǒng)中用作藍(lán)白篩選的篩選底物，在蛋白質(zhì)互作激活mel1基因表達(dá)后，酵母細(xì)胞可以分泌表達(dá)Mel1p。 在兩缺培養(yǎng)基上長出墨綠色的菌落，是否正常? 正常情況下在添加了X-α-gal的雙缺平板上如果有藍(lán)色的菌落長出，說明研究的兩個(gè)蛋白間有陽性的相互作用，如果菌落是白色的說明研究的兩個(gè)蛋白沒有相互作用。出現(xiàn)墨綠色的菌落是一種比較少見的現(xiàn)象，也認(rèn)為是有陽性作用，出現(xiàn)這種顏色上的差異，可能是受酵母代謝產(chǎn)物的影響。對(duì)于這種情況，建議在雙缺的平板上挑取單菌落，在四缺平板上劃線，通過多次劃線的方式進(jìn)一步確定蛋白間的陽性相互作用。 滅菌時(shí)溫度過高，培養(yǎng)基碳化會(huì)導(dǎo)致顏色發(fā)黑，需要保證在121℃,15 min高壓條件下滅菌。 為什么酵母菌在培養(yǎng)基上培養(yǎng)有時(shí)會(huì)變成粉紅色或紅色? ADE2或ADE1菌株在低含量腺嘌呤培養(yǎng)基上生長時(shí)，嘌呤前體積累造成菌株變紅。百瑞極的YPDA培養(yǎng)基采用優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方，可以在很大程度上避免色素的積累。 固體培養(yǎng)基不凝固，是什么原因造成的? 瓊脂添加量正確的情況下，培養(yǎng)基不凝固可能是由于滅菌時(shí)間過長和pH值偏低造成的。部分地區(qū)的水質(zhì)偏酸，這種情況下，建議調(diào)整SD基本培養(yǎng)基的pH值至5.8,YPDA培養(yǎng)基的pH值至6.5,在121℃的條件下，15 min高壓滅菌。 用酵母雙雜交系統(tǒng)驗(yàn)證有明確報(bào)道的有相互作用的蛋白間的作用，結(jié)果出現(xiàn)假陰性，一個(gè)星期之后還是看不到藍(lán)色菌落，原因是什么? 測(cè)不到陽性結(jié)果可能存在以下原因：一、研究的存在相互作用的蛋白是跨膜蛋白或分泌到胞外的蛋白，如果存在這種情況，需要將跨膜區(qū)或者信號(hào)肽序列都去除，因?yàn)榻湍鸽p雜交系統(tǒng)驗(yàn)證蛋白相互作用是在核內(nèi)進(jìn)行的；二、雜交的蛋白在宿主細(xì)胞中表達(dá)不穩(wěn)定，GAL4融合區(qū)域堵塞了相互作用的位點(diǎn)，雜交蛋白在酵母體內(nèi)進(jìn)行了不正確的折疊都會(huì)影響到兩個(gè)蛋白相互作用的驗(yàn)證；三、有研究表明，有些存在弱相互作用的蛋白最長半個(gè)月以后才可以看到陽性結(jié)果。建議在進(jìn)行酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)之前對(duì)相關(guān)的蛋白特性進(jìn)行分析，或者重復(fù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行試驗(yàn)結(jié)果的驗(yàn)證。
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