常見(jiàn)細(xì)胞器染色(3)——細(xì)胞核
01
細(xì)胞核的結(jié)構(gòu)
細(xì)胞核的結(jié)構(gòu)有核膜、核仁、染色質(zhì)、核基質(zhì)。主要功能是遺傳物質(zhì)DNA儲(chǔ)存和復(fù)制的主要場(chǎng)所,是細(xì)胞遺傳和代謝的控制中心。
1.核膜:雙層膜,其上有核孔,是細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)之間的物質(zhì)交換通道,表現(xiàn)出明顯的選擇性,RNA、蛋白質(zhì)等大分子進(jìn)出必須通過(guò)核孔。
2.核仁:在細(xì)胞有絲分裂過(guò)程中周期性消失(前期)和重現(xiàn)(末期)。
3.染色質(zhì):能被堿性染料染成深色的物質(zhì),主要由DNA和蛋白質(zhì)組成。
4.核基質(zhì):是核中除染色質(zhì)與核仁以外的成分,包括核液與核骨架兩部分。
02
細(xì)胞核的功能
控制細(xì)胞的遺傳,生長(zhǎng)和發(fā)育。
細(xì)胞核是細(xì)胞的控制中心,一般說(shuō)真核細(xì)胞失去細(xì)胞核后,很快就會(huì)死亡,但紅細(xì)胞失去核后還能生活120天;植物篩管細(xì)胞,失去核后,能活好幾年。
03
為什么要對(duì)細(xì)胞核染色?
從細(xì)胞核的結(jié)構(gòu)可以看出,細(xì)胞核中最重要的結(jié)構(gòu)是染色質(zhì),染色質(zhì)的組成成分是蛋白質(zhì)分子和DNA分子,而DNA分子又是主要遺傳物質(zhì)。當(dāng)遺傳物質(zhì)向后代傳遞時(shí),必須在核中進(jìn)行復(fù)制。
細(xì)胞核又是細(xì)胞遺傳性和細(xì)胞代謝活動(dòng)的控制中心。遺傳物質(zhì)能經(jīng)復(fù)制后傳給子代,同時(shí)遺傳物質(zhì)還必須將其控制的生物性狀特征表現(xiàn)出來(lái),這些遺傳物質(zhì)絕大部分都存在于細(xì)胞核中。
04
如何選擇對(duì)細(xì)胞核染色的染料?
1. 對(duì)死細(xì)胞染色的染料
PI是一種核酸熒光染料,可用于哺乳動(dòng)物、細(xì)菌、酵母的染色。它不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜,但能夠透過(guò)死細(xì)胞和凋亡中晚期細(xì)胞的細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染色。因此,PI 作為熒光探針常用于細(xì)胞凋亡(apoptosis)或細(xì)胞壞死(necrosis)的檢測(cè)。進(jìn)入細(xì)胞后,PI 與 DNA 和 RNA 結(jié)合,熒光強(qiáng)度增強(qiáng) 20-30 倍。在流式細(xì)胞分析中,PI 常與其他染料如Calcein-AM 、 Hoechst 33258 或 Hoechst 33342 聯(lián)合使用,來(lái)區(qū)分凋亡早晚期細(xì)胞以及死細(xì)胞。此外,PI 也常作為多色熒光染色的復(fù)染劑使用。
Ethidium Homodimer-I (EthD-I) 是一種高親和性的熒光核酸染料,與 DNA 或 RNA 結(jié)合后,可以使熒光增強(qiáng) 30 多倍,與 DNA 結(jié)合后發(fā)紅色熒光(最大激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)分別為大約528/617nm)。常常用于哺乳動(dòng)物、細(xì)菌、酵母和真菌的染色。(EthD-I)帶有較強(qiáng)正電荷,所以該染料不能穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)行活細(xì)胞染色。但是 EthD-I 可以準(zhǔn)確的檢測(cè)溶液中的核酸或者解體細(xì)胞中的核酸,是一種較靈敏的核酸染色劑。
ethidium homodimer-1(紅色)染色的結(jié)直腸癌Caco-2 3D細(xì)胞團(tuán)
7-AAD是一種非滲透性的核酸熒光染料。該染料不能透過(guò)活細(xì)胞的細(xì)胞膜,但可穿透膜損傷細(xì)胞如晚期凋亡細(xì)胞或者壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜并與其內(nèi)的DNA結(jié)合,可用來(lái)區(qū)分存活的早期細(xì)胞和壞死或晚期凋亡細(xì)胞,廣泛用于流式細(xì)胞儀。7-AAD與DNA結(jié)合后可發(fā)出強(qiáng)烈的熒光,其熒光特性與PI相似,可被488nm氬離子激光激發(fā),但其發(fā)射光譜較PI窄,且發(fā)射波長(zhǎng)更長(zhǎng),對(duì)其他檢測(cè)通道的干擾更小,在多色熒光分析中是PI的最佳替代品,可與多種488激發(fā)光激發(fā)的熒光染料聯(lián)合使用,如FITC,PE等。
Oxazole yellow等同于YO-PRO-1 Iodide,是一種非細(xì)胞膜穿透性的高親和力的羰花青單體核酸綠色熒光染料,在沒(méi)有核酸的情況下基本上是非熒光的。該染料可用于鑒定凋亡細(xì)胞,Oxazole yellow可滲透進(jìn)入早期凋亡細(xì)胞,對(duì)早期凋亡細(xì)胞進(jìn)行染色,而碘化丙錠(PI, P4034)(一種死細(xì)胞染色)對(duì)早凋細(xì)胞保持非滲透性,但可染色晚凋細(xì)胞,這兩種染料結(jié)合使用,可以區(qū)分早凋細(xì)胞和晚凋細(xì)胞。由此,本司推出了Oxazole yellow和PI聯(lián)合的膜透性細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒,用于區(qū)分早凋和晚凋細(xì)胞。以貼壁細(xì)胞(96孔板)舉例,每孔100 μL染色工作液,配置為工作液(5 μM)大概可以用于2000個(gè)孔的染色。
DAPI 是一種可對(duì)DNA 染色的細(xì)胞核染色試劑,它在嵌入雙鏈DNA后釋放藍(lán)色熒光。DAPI 常用于細(xì)胞凋亡檢測(cè),染色后用熒光顯微鏡觀察或流式細(xì)胞儀檢測(cè)。盡管DAPI 不能通過(guò)活細(xì)胞膜,但卻能穿透擾亂的細(xì)胞膜而對(duì)核染色。DAPI 具有很高的光漂白承受水平,能用來(lái)檢測(cè)酵母線粒體DNA,葉綠體 DNA,病毒DNA,microplasmDNA 以及染色體DNA。DAPI-DNA 復(fù)合物的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為 360 nm 和 460 nm。
DAPI將細(xì)胞核染為藍(lán)色
2. 對(duì)活細(xì)胞染色的染料
Draq 5 是一種遠(yuǎn)紅外熒光活細(xì)胞 DNA 染料,是一種對(duì)雙鏈 DNA 具有高親和力的蒽醌染料。它是一種可以透過(guò)細(xì)胞膜的染料,可標(biāo)記活細(xì)胞或固定后/死細(xì)胞。在流式細(xì)胞術(shù)中,這種染料可用于區(qū)分有核和無(wú)核細(xì)胞。由于 Draq5能夠按照化學(xué)計(jì)量比結(jié)合至 DNA,因此還可用于報(bào)告細(xì)胞核 DNA 含量,適用于染色體倍數(shù)和細(xì)胞周期分析。在熒光顯微鏡分析中,它可用作細(xì)胞核復(fù)染劑。Draq5 有很多應(yīng)用,高度兼容現(xiàn)有儀器平臺(tái)廣泛使用的程序,主要的應(yīng)用領(lǐng)域?yàn)?HCS,細(xì)胞模型,GFP,流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡。
Draq 5 將細(xì)胞核染為藍(lán)色
Hoechst 33342是一種可以穿透細(xì)胞膜的藍(lán)色熒光 染料,對(duì)細(xì)胞的毒性較低。Hoechst 33342 染色常用于細(xì)胞凋亡檢測(cè),染色后用熒光顯微鏡觀察或流 式細(xì)胞儀檢測(cè)。Hoechst 33342 也常用于普通的細(xì)胞核染色,或常規(guī)的 DNA 染色。Hoechst 33342 染色液可直接用于固定細(xì)胞或組織的細(xì)胞核染色,也可直接用于活細(xì)胞或組織的細(xì)胞核染色。
Ex/Em(結(jié)合DNA)= 346/460 nm
Ex/Em(未結(jié)合DNA)= 350/ 461nm
Hoechst 33258,也稱bis Benzimide H 33258或HOE 33258,是一種非嵌入性的亮藍(lán)色熒光染料。染料在溶液中熒光較弱,它們?cè)诨罴?xì)胞中DNA聚AT序列富集區(qū)域的小溝處與DNA結(jié)合后熒光變得明亮,故此類染料也被稱為DNA探針。因背景較低,故染色細(xì)胞不需洗滌步驟,且染色非常穩(wěn)定,對(duì)活細(xì)胞無(wú)毒,結(jié)合DNA染色后可持續(xù)幾天或更長(zhǎng)時(shí)間。Hoechst 33258與Hoechst 33342相比在水中的溶解度要高,但兩種染料均具有高細(xì)胞膜滲透性,被廣泛用于細(xì)胞凋亡檢測(cè),染色后可用熒光顯微鏡觀察或流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
Ex/Em(結(jié)合DNA)= 352/461 nm
Ex/Em(未結(jié)合DNA)= 346/460 nm
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