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細(xì)胞凋亡（apoptosis）也稱為程序性細(xì)胞死亡（programmed cell death），在多個(gè)信號(hào)通路的參與下，是一個(gè)高度受控的過程。細(xì)胞凋亡不僅可以去除機(jī)體不再需要的、多余的細(xì)胞和組織，使機(jī)體正常生長(zhǎng)和發(fā)育，而且還能殺死過剩的免疫細(xì)胞和受到病毒感染或出現(xiàn)DNA損傷的細(xì)胞，最大限度地減少這些細(xì)胞對(duì)機(jī)體的威脅。

區(qū)別于損傷導(dǎo)致的細(xì)胞壞死，凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征為核染色質(zhì)凝聚、細(xì)胞皺縮，以及膜結(jié)合的凋亡小體的產(chǎn)生，還會(huì)出現(xiàn)DNA片段化和多種胞內(nèi)蛋白的分解或降解。

檢測(cè)細(xì)胞凋亡的方法有很多，有根據(jù)凋亡細(xì)胞固有的形態(tài)特征，利用光學(xué)顯微鏡、激光掃描共聚焦顯微鏡和透射電子顯微鏡等來觀察細(xì)胞形態(tài)；也有根據(jù)細(xì)胞凋亡過程中的時(shí)相變化檢測(cè)是否發(fā)生凋亡，常見的有Caspase活性檢測(cè)、Annexin V檢測(cè)、線粒體膜電位檢測(cè)、TUNEL檢測(cè)等。細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，不同區(qū)域內(nèi)（如細(xì)胞膜、細(xì)胞漿、線粒體、細(xì)胞核等）會(huì)發(fā)生不同的生理生化改變。因此，針對(duì)不同區(qū)域的細(xì)胞凋亡檢測(cè)要采用不同的方法。

細(xì)胞凋亡有個(gè)典型特征是線粒體活性受損，包括膜電位和線粒體氧化還原能力的改變。發(fā)生這些的主要原因是線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔的打開，引起離子和小分子的進(jìn)出和細(xì)胞色素c的釋放。

JC-1是一種廣泛用于檢測(cè)線粒體膜電位的理想熒光探針。可以檢測(cè)細(xì)胞、組織或純化的線粒體膜電位，線粒體膜電位的下降是細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)標(biāo)志性事件。正常生理狀態(tài)下，線粒體負(fù)電性高，JC-1進(jìn)入線粒體以多聚體存在，紅色熒光強(qiáng)，細(xì)胞凋亡時(shí)，線粒體去極化產(chǎn)生，負(fù)電性降低，JC-1則以單體存在細(xì)胞質(zhì)，綠色熒光增強(qiáng)。

這樣就可以非常方便地通過熒光顏色的轉(zhuǎn)變來檢測(cè)線粒體膜電位的變化。但是，這種方法不能區(qū)分細(xì)胞凋亡或其他原因?qū)е碌木€粒體膜電位的變化。

線粒體膜電位探針JC-1 染料

JC-1 染料法檢測(cè)線粒體膜電位變化

細(xì)胞膜在整個(gè)細(xì)胞凋亡過程中都會(huì)持續(xù)發(fā)生變化。細(xì)胞膜變形或起泡發(fā)生在細(xì)胞凋亡早期，隨著細(xì)胞凋亡的進(jìn)展，細(xì)胞膜脂質(zhì)成分和完整性也會(huì)發(fā)生變化。例如，磷脂酰絲氨酸（PS）從細(xì)胞質(zhì)膜的內(nèi)部小葉外翻到外部小葉上，進(jìn)而暴露在細(xì)胞外部環(huán)境中。

凋亡細(xì)胞質(zhì)膜上PS的外翻

Annexin Ⅴ是一種分子量為35-36kD的Ca依賴性磷脂結(jié)合蛋白，正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine, PS）只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，細(xì)胞發(fā)生凋亡早期，膜磷脂酰絲氨酸（PS）由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。Annexin V作為一種磷脂結(jié)合蛋白，可以特異性地識(shí)別凋亡細(xì)胞表面的PS, 而活細(xì)胞的PS位于細(xì)胞膜的內(nèi)表面，無法與Annexin V特異性結(jié)合。所以可以用FITC偶聯(lián)的annexin V鑒別凋亡細(xì)胞和活細(xì)胞。Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒標(biāo)記后可以使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI能夠透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染。壞死細(xì)胞的PS也會(huì)從細(xì)胞膜的內(nèi)表面翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的外表面，Annexin V也能識(shí)別壞死細(xì)胞表面的PS, 所以Annexin V無法區(qū)分壞死細(xì)胞和凋亡細(xì)胞。而PI染料能夠與細(xì)胞內(nèi)的DNA結(jié)合，區(qū)分壞死細(xì)胞和活細(xì)胞。早期凋亡細(xì)胞和活細(xì)胞的細(xì)胞膜仍然完整， PI染料無法自由通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與DNA結(jié)合，所以PI染料無法標(biāo)記凋亡細(xì)胞和活細(xì)胞，而PI染料卻能夠通過壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜與細(xì)胞內(nèi)的DNA結(jié)合，壞死細(xì)胞內(nèi)PI染料被488nm激光激發(fā)后會(huì)發(fā)射紅熒光，被相應(yīng)通道接收。所以Annexin V和PI同時(shí)使用，就可以區(qū)分活細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。

Q1：左上象限（UL）為（Annexin V-/PI+），可能是已經(jīng)沒有細(xì)胞膜的細(xì)胞碎片，或者其他原因?qū)е碌乃劳黾?xì)胞；

Q2：左下象限（LL）為正常（活）細(xì)胞（Annexin V-/PI-）；

Q3：右上象限（UR）為晚期凋亡細(xì)胞（Annexin V+/PI+）；

Q4：右下象限（LR）為早期凋亡細(xì)胞（Annexin V+/PI-）。

半胱天冬酶（Caspase）活化是細(xì)胞凋亡早期的重要信號(hào)。半胱天冬酶屬于半胱氨酸-天冬氨酸特異性蛋白酶家族，是細(xì)胞凋亡相關(guān)的復(fù)雜細(xì)胞過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。絕大多數(shù)情況下，所有的凋亡信號(hào)都會(huì)匯集到凋亡的最終執(zhí)行者 Caspase-3 上。在正常細(xì)胞中，Caspase-3 以酶原形式存在，在凋亡早期 Caspase-3 被激活，并執(zhí)行最后的凋亡程序。因此可以通過檢測(cè) Caspase 3 剪切體的含量或 Caspase 3 的活性來反應(yīng)細(xì)胞凋亡過程。此外，也可以通過檢測(cè) Caspase-3 的底物——PARP 蛋白的含量來檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

半胱天冬酶活性檢測(cè)試劑盒SuperViewTM 488 Caspase-3 Assay Kit for Live Cells

細(xì)胞凋亡過程中細(xì)胞核形態(tài)變化的特征是DNA鏈斷裂、DNA片段化、核膜降解和細(xì)胞核起泡、產(chǎn)生微核。

細(xì)胞凋亡中, 染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量的粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)的作用下，將脫氧尿苷三磷酸核苷酸(dUTP)和熒光素形成的衍生物標(biāo)記到DNA的3'-末端，從而可進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測(cè)，稱為TUNEL法。由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3'-OH形成，很少能夠被染色。由此，TUNEL是檢測(cè)DNA片段化（細(xì)胞凋亡）的最常用方法。

TUNEL 法檢測(cè)苦參堿刺激下 HepG2 細(xì)胞凋亡情況

TUNEL的全稱是Terminal Deoxynucleotidyl Transferase mediated dUTP Nick-End Labeling，中文名為末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP原位切口末端標(biāo)記。是分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究方法，對(duì)完整的單個(gè)凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色，能準(zhǔn)確的反應(yīng)細(xì)胞凋亡最典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征，可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養(yǎng)的細(xì)胞和從組織中分離的細(xì)胞的細(xì)胞凋亡測(cè)定，并可檢測(cè)出極少量的凋亡細(xì)胞，靈敏度遠(yuǎn)比一般的組織化學(xué)和生物化學(xué)測(cè)定法要高，因而在細(xì)胞凋亡的研究中已被廣泛采用。

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