隨著生命科學(xué)的發(fā)展，圍繞蛋白進(jìn)行的研究越來越多，抗體試劑在實(shí)驗(yàn)中的重要性越來越舉足輕重。面臨著紛呈復(fù)雜 的抗體試劑市場(chǎng)，如何選擇到適合自己實(shí)驗(yàn)的抗體就變得尤為重要。
當(dāng)我們要檢測(cè)目的蛋白在組織中表達(dá)情況的時(shí)候，如何選擇適合我們實(shí)驗(yàn)需要的抗體，并恰當(dāng)保存使用，是每個(gè)科研 人員需要細(xì)心考慮的。抗體種類繁多，品牌眾多，技術(shù)參數(shù)不一，價(jià)格和質(zhì)量更是相差甚大，如何購買到高質(zhì)量價(jià)格合適 的抗體，并準(zhǔn)確地做出我們想要的結(jié)果，其中有很多細(xì)節(jié)需要注意。
一、一抗的選擇
目的蛋白的信息
確定檢測(cè)的目的蛋白是否與抗體識(shí)別蛋白信息吻合，注意中英文名稱、別名等信息。
某些蛋白具有多種不同的亞型，這需要在選擇抗體之前確定要研究的蛋白亞型。還有些抗體由于其抗原選擇的是 不同蛋白亞型共有的肽段區(qū)域，是可以同時(shí)識(shí)別多個(gè)亞型的。有的蛋白通過剪切加工才能轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓幕钚孕问剑?Caspase、Insulin 等，這就需要根據(jù)研究需要，選擇針對(duì)前體或成熟形式的特異性抗體。
抗體制備所用抗原的信息
抗體是由各種不同抗原免疫宿主制備得來，抗原類型包括：全長蛋白、蛋白片段、多肽、全有機(jī)體 ( 如：細(xì)菌 ) 或細(xì)胞， 抗體說明書一般都有制備抗體所用抗原的描述。在有些情況下，需要查閱抗體制備相關(guān)抗原信息來選擇抗體。比如，針對(duì) 重組表達(dá)蛋白選擇抗體，如果是表達(dá)部分蛋白片段，則需要注意抗體的抗原區(qū)域是否在該片段區(qū)域內(nèi)。如果打算用 FACS 流式檢測(cè)活細(xì)胞的表面蛋白，則需選擇含該表面蛋白的胞外域來免疫制備的抗體。某些特殊蛋白 ( 如病原體蛋白 ) 未經(jīng)過 內(nèi)部驗(yàn)證種屬的目的蛋白，需要求助生產(chǎn)商進(jìn)行蛋白同源性序列比對(duì)，并結(jié)合制備抗體所用的抗原序列，查看交叉反應(yīng)的 情況。
某些抗體要求樣本經(jīng)過某些特殊處理，例如：許多抗體只識(shí)別還原和變性的、表位已暴露不受二級(jí)四級(jí)結(jié)構(gòu)阻礙的蛋 白樣本，另一方面，某些抗體僅識(shí)別天然折疊狀態(tài)的蛋白。當(dāng)選擇免疫組化的抗體時(shí)，應(yīng)注意某些抗體只識(shí)別未固定的冷 凍的組織，而另一些抗體則適用于無需抗原修復(fù)解交聯(lián)步聚的甲醛固定石蠟包埋的組織，這些都會(huì)在抗體說明書上應(yīng)用部 分標(biāo)示出來。
了解樣本抗原蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì)有助于選擇最合適的抗體，待測(cè)樣本蛋白的結(jié)構(gòu)域和樣本在提取和處理過程中是否會(huì)變 性，蛋白空間構(gòu)象的改變，會(huì)影響抗體的免疫親和反應(yīng)。
修飾位點(diǎn)的信息
在選擇合適的抗體用于特定修飾位點(diǎn)研究時(shí)，需要特別注意，不同位點(diǎn)的修飾可能有不同的機(jī)制存在，不宜一概而論。 有關(guān)不同修飾位點(diǎn)的功能，可以通過查閱文獻(xiàn)確定。另外，由于有的蛋白存在不同亞型且序列高度同源，而不同亞型的某 些磷酸化修飾位點(diǎn)周圍的序列完全相同，因此針對(duì)這些保守的修飾位點(diǎn)的抗體往往會(huì)同時(shí)識(shí)別不同亞型的相似修飾位點(diǎn)。
實(shí)驗(yàn)樣本的種屬信息
抗體一般會(huì)在出廠前對(duì)常見的不同種屬目標(biāo)樣本進(jìn)行內(nèi)部驗(yàn)證，以確定可以滿足的不同種屬類型，可以在產(chǎn)品說明書 的 Species-Reactivity 一欄中看到 ( 如人、小鼠、大鼠等 )。通過驗(yàn)證，達(dá)到質(zhì)檢要求的種屬會(huì)明確標(biāo)記，以備參考。一些 沒有標(biāo)明的種屬，也有可能是可以應(yīng)用的，建議通過聯(lián)系抗體公司技術(shù)支持來獲得相關(guān)抗原序列比對(duì)的信息，根據(jù)蛋白同 源性的情況以確定是否可以用于該種屬的樣本。為了避免實(shí)驗(yàn)風(fēng)險(xiǎn)，盡量不要使用說明書中沒有提及的標(biāo)本的種屬的抗體。
抗體應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)類型
抗體一般會(huì)在出廠前對(duì)常見的抗體應(yīng)用 (WB、IP、ChIP、IHC、IF、FCM) 進(jìn)行內(nèi)部驗(yàn)證，以確定是否可以滿足不同 應(yīng)用要求。通過驗(yàn)證，達(dá)到質(zhì)檢要求的抗體會(huì)明確標(biāo)記，以備參考。一些沒有標(biāo)明的應(yīng)用，往往是因?yàn)榻?jīng)過驗(yàn)證沒有達(dá)到 質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn) , 因而不推薦根據(jù)經(jīng)驗(yàn)或常識(shí)去推測(cè)某個(gè)抗體的應(yīng)用。比如，有的客戶會(huì)認(rèn)為，既然某個(gè)抗體可以用于 IHC，根 據(jù)經(jīng)驗(yàn)推斷應(yīng)該可以用于 IF，但畢竟這是兩個(gè)不同的應(yīng)用，這樣做可能會(huì)浪費(fèi)很多時(shí)間和試劑而不能獲得結(jié)果。抗體廠家 不推薦您使用沒有標(biāo)明的應(yīng)用，可以挑選其他的貨號(hào)，可能有適用于這個(gè)應(yīng)用的更好的其它產(chǎn)品。如果抗體說明書沒有提 及的應(yīng)用類型，并不意味著該抗體一定不適用于此種應(yīng)用類型，而僅是說明尚未通過此種應(yīng)用的內(nèi)部驗(yàn)證。為了避免實(shí)驗(yàn) 風(fēng)險(xiǎn)，當(dāng)計(jì)劃使用說明書中沒有提及的應(yīng)用方法時(shí)，可向生產(chǎn)商申請(qǐng)?jiān)囉醚b，進(jìn)行初步預(yù)實(shí)驗(yàn)后，再?zèng)Q定是否購買。 標(biāo)記物的信息 有一些實(shí)驗(yàn)，如多重免疫熒光、多指標(biāo)流式測(cè)定可能會(huì)使用到直接標(biāo)記的一抗(簡稱直標(biāo)一抗)。在進(jìn)行直標(biāo)一抗選擇時(shí)， 需要了解到自己將要使用的儀器能檢測(cè)到的熒光范圍，針對(duì)不同的參數(shù)要求選擇合適的標(biāo)記物。在設(shè)計(jì)多重實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)考 慮每種熒光基團(tuán)的獨(dú)特性質(zhì)，如最大吸收波長和最大發(fā)射波長，消光系數(shù)和斯托克斯位移等因素。有關(guān)標(biāo)記物選擇的細(xì)節(jié)， 我們將在后面的免疫熒光與流式技術(shù)部分詳加介紹。 文獻(xiàn)引用情況 有的時(shí)候，針對(duì)某一個(gè)蛋白可能有不同貨號(hào)的產(chǎn)品，很多人喜歡通過查閱文獻(xiàn)來確定自己將要選擇的抗體貨號(hào)是否有 過較好的表現(xiàn)。一般抗體公司都會(huì)收集引用自己產(chǎn)品的文獻(xiàn)，這些產(chǎn)品都是經(jīng)過 SCI 驗(yàn)證過的，所以大可放心地使用。不過， 也不排除抗體公司近期生產(chǎn)出更好的抗體，可以向公司咨詢。
二、二抗的選擇
一抗的來源種屬
主要根據(jù)一抗來源種屬而決定二抗，如一抗是小鼠來源，那二抗就選擇抗小鼠的即可。
二抗應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)類型
針對(duì)不同的實(shí)驗(yàn)應(yīng)用，需要考慮二抗所偶聯(lián)的標(biāo)記物，如 HRP、Biotin、熒光素等。WB 與 IHC 所用的二抗，所帶的 標(biāo)記物主要選擇 HRP 和 Biotin，而免疫熒光和流式應(yīng)用可根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的需要，選擇不同熒光素標(biāo)記的二抗，如 FITC、 Cy3、PE 等。
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